Protéines de Synthèse et Chimie Bioorthogonale

Responsable : Vincent AUCAGNE

Descriptif du travail de recherche :
◊ Nouveaux outils chimiques pour la synthèse de protéines

La production de protéines par synthèse « totale » est un champ de recherche en plein essor. Cette approche est très complémentaire des techniques recombinantes pour des applications de décryptage de mécanismes biologiques via des outils conçus sur-mesure (chemical biology) ou de développement de nouveaux médicaments. Cette voie alternative est particulièrement intéressante pour accéder à des protéines modifiées (modifications post-traductionnelles, marquage sélectif, introduction de sondes, d’acides aminés non-naturels, modification du squelette peptidique…) ou difficiles à produire (protéines cytotoxiques, riches en ponts disulfures…).
Les technologies actuelles se focalisent sur des approches d’assemblage modulaire de fragments peptidiques de quelques dizaines d’acide aminés, par le biais de réactions très sélectives de « ligation chimique » permettant de travailler avec des peptides non-protégés. Cette approche a révolutionné le domaine il y a maintenant une trentaine d’années et se démocratise peu à peu pour la synthèse de petites protéines (50-100 acides aminés). Toutefois, l’accès à des cibles plus ambitieuses en termes de taille ou de complexité moléculaire demeure un véritable tour de force encore réservé à de rares spécialistes, souvent au prix d’efforts et d’investissements considérables.

Trois verrous technologiques majeurs restent à surmonter :

- L'assemblage de nombreux fragments par ligations successives, qui se heurte à la nécessité de purifier les différentes intermédiaires réactionnels ; ceci conduit à de très faibles rendements globaux,

- La manipulation de fragments peu solubles ou propices à l'agrégation, un problème très fréquemment rencontré,

- La mise au point de méthodes de ligation plus efficaces, tant du point de vue de la nature des réactions chimiques mises en oeuvre que de la synthèse de fragments peptidiques adéquatement fonctionnalisés.

Notre groupe cherche à apporter des solutions originales à chacun des trois verrous précédemment évoqués. Nous avons ainsi peu à peu constitué une boîte à outils moléculaires cohérente, se voulant robuste et polyvalente.

◊ Développement de nouveaux bras N-terminaux

Un accent particulier a été mis sur le développement de techniques permettant un assemblage sur support solide afin de s’affranchir des étapes de purifications intermédiaires. Dans ce but, nous avons introduit une gamme de nouveaux bras (linkers) permettant l’immobilisation spécifique d’un premier fragment peptidique pur et non-protégé sur un support solide adapté. Des bras similaires ont également été appliqués à la modification temporaire de fragments peptidiques hydrophobes et propices à l’agrégation, dans le but de les rendre solubles par adjonction de résidus chargés (p. ex. étiquette hexalysine). Le principal enjeu est de maitriser les conditions nécessaires à la coupure de ces bras, afin de décrocher du support solide la protéine assemblée par ligations successives ou d’éliminer les groupements solubilisants.

◊ Peptides crypto-thioesters

La réaction la plus utilisée pour la synthèse de protéines a été découverte il y a une vingtaine d’années et est appelée ligation chimique native (native chemical ligation, ou NCL). Elle consiste en la réaction de fragments peptidiques équipés respectivement d’une fonction thioester et d’une cystéine N-terminale. Si la synthèse du fragment cystéinylé peut être réalisée en routine, celle du fragment thioester est à ce jour encore très problématique. En effet, les conditions réactionnelles employées le plus couramment en synthèse peptidique sur phase solide (stratégie Fmoc/tBu) sont intrinsèquement incompatibles avec la fonction thioester.

Inspirés par la formation spontanée d’une fonction thioester lors de l’auto-épissage protéique, processus de maturation non enzymatique de certaines protéines impliquant l’excision spontanée d’une partie appelée intéine, nous avons conçu un dispositif moléculaire programmé pour former un thioester in situ dans les conditions réactionnelles de la NCL : on parle alors de peptides crypto-thioester. Ce procédé bio-inspiré présente l’avantage de ne pas nécessiter d’étape chimique supplémentaire après synthèse peptidique en phase solide. Il peut être totalement automatisé par les robots de synthèse, et à moindre coût, ce qui rend très abordable sa mise en œuvre par des non-spécialistes. Les peptides crypto-thioester ainsi obtenus sont stables et peuvent être manipulés, analysés et purifiés par les techniques classiques, et sont directement utilisables dans une réaction de NCL, avec des cinétiques très rapides de transformation en thioester.

◊ Ligation triazole peptidomimétique

En recherchant des réactions alternatives à la NCL, nous avons démontré la possibilité d’utiliser la cycloaddition alkyne / azoture catalysée par le CuI (CuAAC) dans le contexte de la synthèse de protéines. Cette réaction hautement chimiosélective conduit à la formation d'un 1,2,3-triazole 1,4-disubstitué qui est reconnu comme un excellent mime d'une liaison amide trans: la CuAAC peut donc être considérée comme une méhode de ligation peptidomimétique.

De plus, les triazoles ne peuvent pas être hydrolysés par des protéases, et cette caractéristique a été exploitée pour le développement de peptidomimétiques avec une stabilité in vivo accrue, dans un contexte de drug discovery.

◊ Synthèse de miniprotéines riches en disulfure

Les peptides riches en disulfure (DRP) forment une famille de produits naturels très variés et ubiquitaires dans le vivant. Ils sont composés de 10 à 90 acides aminés et caractérisés par des cystéines évolutivement conservées qui sont réticulées par un réseau dense de ponts disulfures. Ces composés sont remarquablement stables et compacts et présentent des activités biologiques très diverses, ce qui en fait des composés attrayants en tant qu'outils pharmacologiques ou pour le développement de médicaments.

Notre groupe possède une expertise pointue dans la synthèse de ces composés, y compris leur repliement oxydatif pour obtenir la connectivité naturelle des ponts disulfure. Les méthodologies de synthèse par ligation que nous avons développées nous permettent maintenant de synthétiser des DRP très longs, particulièrement difficiles d'accès par les méthodes classiques.

◊ Nouvelles stratégies pour une immunothérapie des cancers

Les antigènes glucidiques présents sur les mucines surproduites par les cellules tumorales sont des marqueurs des tumeurs et sont en partie responsables de l’inaction du système immunitaire vis-à-vis des tumeurs. La densité ainsi que la structure des glycanes portés par les mucines des cellules tumorales jouent un rôle prépondérant dans l’anergie des cellules immunes. Les mucines utilisées jusqu’alors pour étudier ce processus étaient constituées de mélanges hétérogènes de glycoprotéines portant de multiples structures de glycanes. Afin de mieux cerner la relation entre la structure des glycanes et la réponse immune, il est nécessaire de produire des mucines de taille variable portant des glycanes de structure bien définie. Nous avons pour cela développé des méthodes de synthèse de glycoprotéines sur support solide, alliant synthèse chimique et synthèse enzymatique. Disposer de glycoprotéines de taille et de structure homogène, permettra d’étudier précisément le rôle des glycanes dans l’endocytose et la présentation des antigènes par les cellules dendritiques et les macrophages.

De nombreux antigènes tumoraux pourraient être utilisés comme cibles pour une immunothérapie du cancer. Cependant ils ne provoquent généralement pas de réponse immune car ils sont déjà présents sur les cellules normales au cours du développement embryonnaire. Pour contourner ce problème, nous utilisons des analogues de N-acétylgalactosamine et de précurseurs d’acide sialique qui peuvent être incorporés dans plusieurs antigènes glucidiques tumoraux par le métabolisme particulier et très actif des cellules cancéreuses. En s’exprimant à la surface des cellules, ces sucres chimiquement modifiés sont capables de lier en grande nombre, via des réactions bioorthogonales très spécifiques, des molécules portant des groupements réactifs adéquats. Ainsi une telle approche menée sur des modèles cellulaires et murins peut amener à un ciblage spécifique d’immunostimulants dans le cœur d’une tumeur.

Principales publications :
  • Jacobsen M. T., Petersen M. E., Ye X., Galibert M., Lorimer G. H., Aucagne V. and Kay M. S.
    A Helping Hand to Overcome Solubility Challenges in Chemical Protein Synthesisarticle. Journal of the American Chemical Society (2016) 138 (36) 11775-11782
  • Terrier V. P., Adihou H., Arnould M., Delmas A. F. and Aucagne V.
    A straightforward method for automated Fmoc-based synthesis of bio-inspired peptide crypto-thioesters. Chemical Science (2016) 7 (1) 339-345
  • Galibert M., Piller V., Piller F., Aucagne V. and Delmas A. F.
    Combining solid phase chemical ligations and enzymatic glycosylations for the synthesis of glycoproteins. Chemical Science (2015) 6 (6) 3617-3623
  • Chuh K. N., Zaro B. W., Piller F., Piller, V. and Pratt M. R.
    Changes in Metabolic Chemical Reporter Structure Yield a Selective Probe of O-GlcNAc Modification. Journal of the American Chemical Society (2014) 136 (35) 12283-12295
  • Aucagne V., Valverde I. E., Marceau P., Galibert M., Dendane N. and Delmas A. F.
    Towards the Simplification of Protein Synthesis : Iterative Solid-Supported Ligations with Concomitant Purifications. Angewandte Chemie International Edition (2012) 51 (45) 11320-11324
  • Valverde I., Lecaille F., Lalmanach G., Aucagne V. and Delmas A. F.
    Synthesis of a biologically active triazole-containing analogue of cystatin A through successive peptidomimetic alkyne–azide ligations. Angewandte Chemie International Edition (2012) 51 (3) 718-722
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